Цусны ийлдсээс вирүсийн ДНХ ялгаж Квантын ПГУ хийх нь
Квантын ПГУ(KПГУ) нь урвалд орсон ДНХ-ийн молекулын тоог тогтоож болдгоороо ердийн ПГУ-аас ялгаатай бөгөөд давуу талтай юм. КПГУ явагдах арга зүйн зарчмын ялгаатай 2 үндсэн арга зүй байдаг. Үүнд: 1. Проб дээр үндэслэгдсэн 2. Будаг дээр үндэслэгдсэн. Проб дээр үндэслэгдсэн арга зүйг оношлогоонд хэрэглэдэг бол будаг дээр үндэслэгдсэн арга зүйг судалгаанд голдуу хэрэглэдэг. Практикт проб дээр үндэслэгдсэн арга зүйг Taq-Man, будаг дээр үндэслэгдсэн арга зүйг SYBR Green гэж ихэвчлэн нэрлэдэг.
Проб нь ойролцоогоор 20 орчим нуклеотид урттай 2 үзүүр дээрээ флоуресценц болон шингээгч 2 молекулыг агуулсан ДНХ-олигонуклеотид юм. Абот компанийн m2000sp/m2000rt бүрэн автомат системийг хепатитын В, С вирусийн тоог тогтооход хэрэглэдэг. Энэ систем нь нуклейн хүчлийг биологийн дээжнээс ялгах, улмаар КПГУ-ын холимогийг холих бүрэн автомат робот машин болох m2000sp ба н КПГУ-ыг явуулдаг m2000rt термоциклер машинаас бүрдэнэ.
m2000sp машинаар нуклейн хүчлийг ялган, ПГУ-ын холимогийг бэлтгэх
m2000sp нь бүрэн автомат, робот ажиллагаатай нуклейн хүчил ялгаж, улмаар КПГУ-ын холимогийг бэлтгэдэг машин юм Зураг-1. Хепатитын В вирүсийн ДНХ-ын тоог тогтоох шинжилгээнд Промега компанид үйлдвэрлэсэн “Abbott mSample Preparation system-DNA” цомгийг ашигладаг. Зураг-2. ДНХ ялгах арга ДНХ-ын молекул төмрийн цөмийг бүрхсэн цахиурын исэл бүхий нано хэмжээст соронзон партиклтэй гуанидиум тиоцианитын орчинд сонгомолоор холбогдож улмаар нанопартиклуудыг соронзонгоор татаж уусмалаас салгах цэвэрлэх арга дээр үндэслэгдэнэ.
Цомогт дараах зүйл агуулагдана:
- Лизис буффер 70 мл (100мМтрис, 4,7М гуанидиум тиоцианит, 10% твеен, Potasium acetat)
- Угаах уусмал-1 46 мл (100мМ трис, гуанидиум тиоцианит, детергент)
- Угаах уусмал-2 25 мл (70% спирт)
- Микропартикл 13 мл (8% микропартикл, гуанидиум гидрохлорид)
- Уусгах уусмал 25 мл (Нуклеаза байхгүй ус)
Өвчтөний цусыг ЕДТА бүхий вакум тейнерт авч улмаар центрифугээр цэвэр ийлдсийг ялгаж авна. Ялгаж авсан ийлдэснээс 1 мл орчмыг аван зориулалтын хуруу шилэнд хийж машинд оруулж өгөхөд бэлэн болгоно. Цомгийн уусмалуудыг зориулалтын нэг удаагийн саванд хийж зааврын дагуу м2000sp машин дотор байрлуулна. Цусны ийлдэс, урвалж, пластик хэрэглэлүүдийг дүүргэж машиныг бүрэн цэнэглэсний дараа командыг компьютерээс өгч ийлдэснээс вирүсийн ДНХ ялгах ажиллагааг m2000sp машин дээр эхлүүлнэ. Ойролцоогоор 2 цагийн дараа 45 хүний цусны ийлдэсээс ДНХ ялгах ажиллагаа дуусч ДНХ-ийн дээжүүд бэлэн болно. ДНХ ялгах үйл ажиллагааны дарааллыг зурагт үзүүлэв (Зураг-3).
Зураг 1. Abbott m2000sp машин.
Зураг 2.Abbott mSample Preparation system-DNA цомог, түүний бүрдэл хэсгүүд
Зураг 3. Цусны ийлдэснээс вирусын ДНХ ялгах ажиллагааны дараалал
Бэлэн болсон ДНХ-ийн дээжүүдээс авч КПГУ-ын урвалжийн холимогтой м2000sp машин автоматаар хольж КПГУ-ын эцсийн дээжүүдэд бэлтгэх бөгөөд түүнийг m2000rt машинд оруулж КПГУ-ыг явуулна.
m2000rt машинаар КПГУ хийх, КПГУ-ын механизм
Хепатит В вирүсийг илрүүлэх, түүний тоог тогтоох КПГУ нь m2000rt машинаар хийгдэнэ Зураг-4.
Зураг 4. Abbott m2000rt машин
Хепатит В вирүсийг илрүүлэх КПГУ-ын найрлагад дараах зүйлс орно. Үүнд:
-Урвалын буффер
-Таq полимеразе энзим
-Нуклеотид трифосфат-ууд (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
-HBV вирүсийн өвөрмөц проб
-Пампкин ургамлын геномд өвөрмөц контрол ПГУ-ын проб
-Эх ДНХ
ПГУ нь нэг эх ДНХ-ийн молекулыг хэдэн тэрбум дахин олшруулдаг тул хамгийн мэдрэг оношлогооны технологи юм. Аботын бүтээсэн хепатитын В вирүсийг илрүүлэх КПГУ-н цомгоор уг вирүсийн S үүрийн толгой хэсгийн домайныг кодлогч генийн бүсийг олшруулдаг. Харин Роше компанийн бүтээсэн цомгоор Core уургийн пре-Core ба Core домайны зааг хэсгийг кодлогч генийн бүсийг олшруулдаг бол Баер компанийн бүтээсэн цомгоор Соre уургийн үндсэн хэсгийг кодлогч генийн бүсийг олшруулдаг Зураг -5.
Зураг 5. Хепатитын В вирүсийн геном ба түүнийг олшруулах төрөл бүрийн цомогнуудын арга зүй.
КПГУ-ын үед хепатитын В вирүсийн геном дээр праймерүүд, проб сууж улмаар ДНХ полимеразе энзим полимержилтыг явуулна. Полиреразе энзим пробнд хүрээгүй байх үед FAM сүүл TAMRA шингээгчийн нөлөөнд орж улмаар түүний үүсгэсэн флоуресценц сигнал мэдэгдэхгүй байна. Харин полимеразе энзим пробын 5‘-төгсгөл дээрх FAM флоуресценц сүүлд хүрч түүнийг салгахад энэ үед флоуресценц сигнал ялгарна. Полимеразе энзим 3‘-төгсгөл дээр ирж түүнийг задлах үед TAMRA сүүл сална. FAM сүүлнээс үүссэн флоуресценц гэрлийг ПГУ-ын машин цикл бүр дээр бүртгэн авч түүнийг урьдчилан боловсруулсан регрессийн муруй дээр тавьж тооцоолох замаар HBV-ийн ДНХ-ийн хэмжээг тогтооно.
